有效识别 ALK 蛋白表达 实现肺癌患者个体化治疗

 

肺癌是全球排名第一位的肿瘤杀手。与 30 年前相比，我国肺癌死亡率上升了 465%^[1]，发病率高居榜首。肺癌通常分为非小细胞肺癌（Non-small-cell carcinoma，NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）。其中 NSCLC 占了肺癌的 85%。

 

随着肿瘤分子生物学的进展，临床上对 NSCLC 的认识正不断深入。研究表明，50% NSCLC 的发生是由于一系列的驱动基因，包括 EGFR，KRAS，ALK，MEK，PI3K，BRAF 等。找到驱动基因，再进行针对性用药，NSCLC 治疗就能事半功倍。研究人员发现，胰岛素受体家族的成员——间变性淋巴瘤激酶（ALK）是 NSCLC 的关键启动癌基因。在 NSCLC 患者中，虽然只有 5%^{[2] [3] [4]} 的患者会出现 ALK 基因重排，但是中国每年新发病例数仍接近 35,000 例 ^[5]。由于 ALK 阳性 NSCLC 具有明确的分子靶点、靶点检测技术以及上市的靶向药物，通过准确诊断 ALK 基因重排， ALK 阳性患者可从酪氨酸激酶抑制剂（克唑替尼）治疗中获益，明显提高临床疗效。

 

从组织学分型上，还有肺腺癌和肺鳞癌之分。由美国病理协会、国际肺癌研究协会、分子病理协会出台的《肺癌分子标志物检测指南 2013》明确指出：所有含有腺癌成分的 NSCLC 均需检测 ALK。今年 6 月，由中国临床肿瘤学会肿瘤生物标志物专家委员会出台的《中国间变性淋巴瘤激酶（ALK）阳性非小细胞肺癌诊断专家共识（2013 版）》（简称《共识》）指出：对于潜在怀疑存在 ALK 基因融合变异的患者均可进行 ALK 融合基因检测。

 

在第七届中国病理医师年会期间，罗氏诊断举办了“ALK 在 NSCLC 中的诊断与经验分享”卫星会，全国知名病理专家就 ALK 检测方法、最新标准化的 ALK 免疫组化检测判读指南等内容进行了探讨。

 

ALK 融合基因的检测方法

 

根据《共识》，荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization, FISH）、基于 PCR 扩增基础上的技术和免疫组织化学法（immunohistochemistry, IHC）均可作为针对 ALK 融合基因检测常用的方法，实验室可以根据组织标本类型选择合适的检测技术。

 

由于大部分克唑替尼治疗 ALK 阳性 NSCLC 的临床试验均是基于 FISH 的诊断，因此，FISH 检测目前仍是确定 ALK 融合基因的参考标准方法。但是，由于 FISH 检测对于操作和判读技术的要求很高，只有 FISH 操作经验丰富的医师判定的结果才具有可靠性；而且晚期 NSCLC 患者通常只能提供 2mm 左右的小活检组织，因此很难保证每个视野存在 50 个以上的癌细胞供结果判读；而且暗视野下无法获得完整的组织形态学结构。FISH 检测结果要求≥15% 的判断界值（cut off）也存在商榷之处，研究结果显示少数 ALK FISH 检测阴性、IHC 检测阳性的患者也能从靶向药物中获益。同时，目前 FISH 检测的成本昂贵，且不能明确 ALK 融合基因的具体融合变体。因此，在现阶段，FISH 检测尚无法适用于中国 ALK 阳性 NSCLC 患者的大规模筛查和诊断。

 

基于 PCR 扩增基础上的 RT-PCR 法检测 ALK 融合基因的特点在于快速、简便易行，能同时明确 ALK 基因已知的融合变体的类型。但是，该方法对于 RNA 提取的质量要求较高，国内部分实验室未具备严格的质量控制条件。此外，无法检测未知的融合型是其最大的不足之处，限制了其在 ALK 诊断中的应用。

 

早期的 ALK 融合蛋白的 IHC 抗体敏感性较低，因此不适宜用于 ALK 融合蛋白的检测。随着技术的改进， 罗氏诊断 VENTANA ALK IHC 检测特异性的提高了检测灵敏度，同时采用全自动化操作，使检验流程和结果判读都得以标准化，可实现与 FISH 结果高度一致性，结果判读的可重复性为 99.7%，为 ALK 检测的临床广泛应用带来了巨大的突破。

图 1：ALK 检测方法比较

 

首款全自动 IHC 检测获认可

 

VENTANA ALK IHC 检测是唯一获得欧盟认证的用于识别适合克唑替尼治疗的患者的体外诊断 IHC 检测，已在全球超过 53 个国家销售。日前，该检测获得了中国国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准在华上市。该项批准基于一项囊括了北京肿瘤医院、中国医学科学院肿瘤医院、复旦大学附属肿瘤医院的 1,100 个中国患者的回顾性研究，证明了 VENTANA ALK IHC 检测与雅培 Vysis ALK Break Apart FISH 探针试剂盒的一致性达 99.23%。

 

VENTANA ALK IHC 技术平台方法使用了基于非内源性半抗原、信号扩增多聚体和辣根过氧化物酶系统的染色信号放大技术。在不影响检测特异性的前提下，提高了敏感性。结果判读时采用二分类系统，即仅为阳性和阴性两种，阳性结果即可诊断为 ALK 阳性 NSCLC。

 

来自复旦大学附属肿瘤医院的免疫组化病例证实，VENTANA ALK IHC 检测具有独特优势。判读标准简单；敏感性高，均为强阳性颗粒，不用判断强度和百分比；全自动检测有效避免操作流程中的误差，可重复性好；可检测 FFPE 的细胞学样本、细针穿刺、支气管活检以及大体样品, 没有最低细胞数要求。最重要的是，价格便宜，可同时用于 ALK 的筛选和诊断。

 

在进行 VENTANA ALK IHC 检测时，建议检测人员使用 10% 的中性福尔马林和锌福尔马林固定后，用石蜡包埋组织样品，时间应不少于 6 小时，但不要超过 24 个小时；为了避免严重影响染色结果，应避免使用 AFA、B5、Bouin’s 或 95% 酒精固定。建议使用保存不超过 3 个月、厚度约为 4 微米的切片，使用正电荷载玻片。

ALK 阳性 NSCLC 诊断流程

 

鉴于 ALK 基因重排或融合的分子诊断各种方法均有优缺点，且我国适用于 ALK 变异检测的肺癌患者人数众多，《共识》中提出一套行之有效的分子诊断流程（见图 3），并认为 IHC 具有方便、易行、价格低的优势，适合于 ALK 阳性 NSCLC 的筛查。FISH 和 RT-PCR 由于结果判读客观，且 qRT-PCR 已获 CFDA 批准用于临床检测，适合于最终的确诊。

 

《共识》专家组推荐 ALK 基因状态检测的总体原则：应综合肺癌获取的各类生物材料的特征、分子检测方法的特点、实验室自身条件，进行多学科大协作，合理采取有效检测方法和流程，以保证 ALK 阳性肺癌的检出率和准确率。

图 3：中国 ALK 阳性 NSCLC 患者诊断流程图

 

注：（1）a：建议优先在以下临床病理特征集中的患者标本中进行筛选：粘液型腺癌、含印戒细胞成分、不吸烟、年龄 <60 岁，但这些特征并非排他性的，即对其他疑有 ALK 融合变异患者均可进行检测；（2）b：对于部分无条件行 VENTANA IHC 检测的医疗机构或中心，常规 ALK IHC 可作为替代筛选方法，但阳性标本需以 FISH、VENTANA IHC 或序列特异性的 PCR 技术进一步确诊（3）ALK 抗体使用推荐：VENTANA IHC 使用专用抗体试剂盒（D5F3）；（4）流程图中 FISH、RT-PCR、VENTANA IHC 技术之间的虚线表示：单一技术检测结果判断不确定时 3 种方法之间可相互验证结果；（5）c：序列特异性的 PCR 技术诊断 ALK 融合基因条件：PCR 产物经测序后序列比对确认或基于特异性荧光探针的即时定量 PCR 检测融合变异，单纯 RT-PCR 产物经电泳后的条带观察不推荐作为 ALK 融合基因诊断依据；（6）请参考 2013 年度美国病理学家学会（CAP）、国际肺癌研究协会（IASLC）、分子病理学协会（AMP）联合发布的《肺癌患者使用靶向药物的分子检测指南》^[6]

 

NSCLC 的分子靶向治疗将越来越依赖于分子靶点变异的分子诊断。临床实践中分子检测的标准化和标准流程的建立对于“提高临床实践能力”起到关键作用。ALK 基因融合变异作为晚期肺癌中的第二个明确应用的分子分型，其诊断方法和流程仍需进一步结合临床数据进行优化。

 

参考文献：